如果新生儿筛查为阳性，医生会再次抽血复查苯丙氨酸浓度，一般会做基因检测，以明确诊断，必要时还会做一些血生化检查（例如尿蝶呤谱检测）等，与其它类似疾病鉴别。

如果新生儿筛查为阴性，家长因为发现异常症状而就诊，医生首先会询问病情，并查体评估生长发育、检查神经系统，通常会怀疑可能是苯丙酮尿症。一般还会进一步做血液氨基酸分析、基因检测、尿蝶呤图谱等，即可确诊。必要时可能会做头颅磁共振检查、脑电图等，评估疾病的严重程度。

问诊和查体

通过询问病史、母亲孕期检查等情况，医生对病情会有初步了解。可能会进行如下身体检查。

• 生长发育评估。主要是测量孩子的体重、身长、头围，评估是否有发育落后。
• 神经系统查体。观察囟门是否闭合、了解闭合的年龄，可以初步评估是否有发育落后；让孩子抓握东西，可以评估肌肉力量；敲击膝盖或足后跟，了解是否有膝腱反射、跟腱反射等正常的生理反射；观察俯卧、翻身、坐或站等动作的完成情况，评估神经系统发育情况。
• 常规查体。观察皮肤及毛发色泽。通过视、听、触、叩等方式，检查心、肺、腹部，初步发现有无器官畸形，例如先天性心脏病等，因为苯丙酮尿症有时会合并这些异常。

确诊和排除性检查

• 血氨基酸分析。新生儿筛查阳性、有相关表现怀疑苯丙酮尿症时，一般都会做这项检查，目的是测定血中苯丙氨酸、酪氨酸浓度，为诊断提供依据。
  • 当血液苯丙氨酸浓度＞120 微摩尔/升（μmol/L），提示有高苯丙氨酸血症；
  • 当血液苯丙氨酸浓度＞120 μmol/L、以及苯丙氨酸/酪氨酸 ＞2.0 时，提示可能为苯丙酮尿症。
• 基因检测。这是确诊苯丙酮尿症的方法。检查报告中会反映以下基因是否有异常：如 PTS 基因、QDPR 基因、PCBD1 基因、GCH1 基因、SPR 基因、DNAJC12 基因等。
  • 通常，出现 1 个以上的基因异常，就可以确诊；但如果只有 1 个异常基因，则还会做其他检查来确诊。原因是，苯丙酮尿症的异常基因多达 600 多种，并且异常基因和表现出来的异常大概有 4%～ 23% 的不一致，也就是说，仅仅 1 个基因异常并不能提供确诊依据，需要其他检查来协助诊断。
  • 基因检测的价格较贵，一般在几千元不等。但由于对判断病情有重要意义，医生一般会推荐在诊断、遗传咨询和评估恢复情况时做这项检查。
• 尿蝶呤图。这项检查可以查找病因、排除相关疾病。通常，在发现血液苯丙氨酸浓度升高时，一般会建议做。在没有基因检测结果时，通过分析尿中的蝶呤浓度，可以辅助诊断。苯丙酮尿症患者的尿新喋呤（N）、尿生物喋呤（B）通常正常或增高，但是 B%（即 B/B+N）会正常。    
• 血 DHPR 测定。这项检查的全称是血依赖细胞膜二氢吡啶受体活性测定， DHPR 即二氢吡啶受体。检测 DHPR 可以与 DHPR 缺乏症相鉴别，通常在发现血苯丙氨酸浓度增高时就会建议做。一般来说，DHPR 缺乏症的 DHPR 活性降低，而苯丙酮尿症的 DHPR 活性正常。
• 四氢生物蝶呤（BH4）负荷试验。检查发现血苯丙氨酸升高、基因检测有异常基因时，可能会建议做这项检查。检查时间可以是 24 小时～28 天不等。

查明病因、评估病情的检查

• 脑电图检查。出现一些神经系统异常表现时，例如全身僵硬强直、姿势异常，有不能解释的异常动作，如双眼上翻、不自主摇头、肢体抖动等，医生常会建议做脑电图。通过检查可以判断是否有脑内异常放电，明确是否存在癫痫（俗称“羊角风”），以决定是否选择抗癫痫药。另外，还可以判断是否有脑功能异常。脑电图包括普通脑电图（检查时间约 20 分钟，在门诊做）、动态脑电图（可携带脑电记录装置回家做或自由移动）、视频脑电监测（有录像的脑电图，佩戴 4～24 小时或以上，在医院做）。医生会视情况选择。
• 颅脑磁共振检查（MRI）。在基本确诊后，医生可能会建议做磁共振评价脑受损的部位和程度，也可以为辅助诊断提供证据。
• 智商测试和发育评估。确诊后，医生可能会建议评估孩子智力发展水平。通常，智商低于 70 为异常，严重者可低于 50。超过 5 岁的孩子才会做智商测试。小于 5 岁的孩子，一般采用发育评估量表判定发育情况，如格尔塞量表等。